* Antagelsen om, at alle karakterer er heteroseksuelle. Det er tydeligt på den måde, karaktererne taler om kærlighed og forhold, og på den måde, de interagerer med hinanden. For eksempel, da Viola forklæder sig som mand, antages hun straks at være forelsket i Orsino, selvom hun aldrig har mødt ham.
* Gennemgivelse af ønske om samme køn som unaturligt eller komisk. Dette ses tydeligst i karakteren af Sir Andrew Aguecheek, som konstant laver vittigheder om sin tiltrækning til mænd. Hans ønske bliver ikke taget alvorligt af nogen, og han bliver ofte latterliggjort for det.
* Det faktum, at stykket ender med et traditionelt heteroseksuelt ægteskab. Dette forstærker ideen om, at heteroseksualitet er den eneste acceptable form for seksuel orientering.
Udtrykket af heteronormativitet i Tolvte Nat er problematisk, fordi det marginaliserer og udelukker ikke-heteroseksuelle mennesker. Det skaber også et klima, hvor det er svært for ikke-heteroseksuelle mennesker at være åbne om deres seksuelle orientering.