I stykket Macbeth spiller Lady Macbeth en afgørende rolle i kong Duncans død. Det er hende, der overbeviser Macbeth om at myrde kongen, og hun hjælper ham med at planlægge og udføre gerningen.
Efter at Macbeth har udtrykt sin tvivl og frygt for at dræbe kongen, bespotter Lady Macbeth ham for at være en kujon og skammer ham til at begå forbrydelsen. Hun påpeger, at han allerede har fået ideen om at dræbe Duncan, og at han kun tøver på grund af hans "svage natur". Hun minder ham også om hans ambition om at blive konge og fortæller ham, at han skal være hensynsløs, hvis han vil nå sine mål.
Lady Macbeths beslutsomhed og manipulation overbeviser til sidst Macbeth om at gå med til hendes plan. Hun redegør for detaljerne om mordet, herunder hvordan og hvornår det skal gøres. Hun beder også Macbeth om at forlade de blodige dolke ved Duncans krop, så skylden falder på kongens vagter.
Efter mordet er begået, er Lady Macbeth i første omgang sikker på, at de vil være i stand til at dække over det. Hun begynder dog hurtigt at vise tegn på skyld og vanvid. Hun bliver besat af blodet på hænderne og kan ikke sove. Hun begynder også at få syner af Duncans spøgelse, som anklager hende for mord.
Lady Macbeths skyld bliver til sidst for meget for hende at bære. Hun dør i stykkets fjerde akt, og hendes død er et vendepunkt for Macbeth. Han bliver endnu mere hensynsløs og tyrannisk, og til sidst mister han forstanden.
Lady Macbeths rolle i kong Duncans død er betydningsfuld, fordi den fremhæver ambitionens magt og farerne ved at tillade ens ønsker at overvinde deres moralske principper. Hun er en kompleks og tragisk karakter, der i sidste ende bliver ødelagt af sin egen ambition og skyld.