Serafinowicz begyndte sin karriere i 1990'erne og optrådte i BBC Radio 1-komedieshowet "The Breeze" og Channel 4-sketchshowet "The Smell of Reeves and Mortimer". Han medvirkede senere i sin egen sitcom, "The Peter Serafinowicz Show" (2001-2004), og har medvirket i en række film, herunder "Shaun of the Dead" (2004), "Hot Fuzz" (2007), "The World's End" (2013) og "Guardians of the Galaxy" (2014).
I de senere år er Serafinowicz blevet mere og mere kendt for sit stemmeskuespil, efter at have givet stemmer til karakterer i "Star Wars:The Force Awakens" (2015), "Sing" (2016), "Moana" (2016) og "The Lego Batman Movie" (2017). Han har også haft tilbagevendende roller i animationsserien "Rick and Morty" (2013-nu) og "BoJack Horseman" (2014-2020).
Udover sit skuespil- og stemmeskuespil har Serafinowicz også instrueret adskillige kortfilm og musikvideoer og har skrevet til en række tv-shows og publikationer. Han er en hyppig gæst i BBC Radio 4-komediepanelet "The News Quiz", og har også været vært for sin egen podcast, "The Peter Serafinowicz Show" (2012-2014).
Serafinowicz er gift med skuespillerinden Sarah Alexander, som han har to børn med. Han er tilhænger af Labour-partiet og har været en højtråbende kritiker af den konservative regering.