* Green Goblin (Norman Osborn) :Dette er hovedskurken og kan spilles fra starten.
* New Goblin (Harry Osborn) :Du låser Harry op som en spilbar karakter ved at fuldføre spillets historietilstand.
Der er ingen andre spilbare nisser i spillet.
Det er vigtigt at bemærke, at Spider-Man 3 (2007) er et singleplayer-spil . Der er ingen multiplayer-tilstande, hvor du kan låse op for nye karakterer.